Ключевые методы лабораторной диагностики распространенных инфекций


Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций подразделяются на несколько больших групп.

Прямые методы, состоящие в выявлении непосредственно в биологическом материале самого вируса или антител к нему.

Непрямые методы-заключаются в искусственной наработке вируса в значительных количествах, и его дальнейшем анализе.

К наиболее актуальным в повседневной практике методам диагностики относятся:

Серологические методы диагностики — выявление в сыворотке крови пациента определенных антител или антигенов в результате реакции антиген-антитело(АГ-АТ). То есть, при поиске у пациента определенного антигена используется соответствующее искусственно синтезированное антитело, и, соответственно, наоборот-при выявлении антител используют синтезированные антигены.

Реакция иммунофлуоресценции (РИФ)

Основана на использовании меченых красителями антител. При наличии вирусного антигена он связывается с мечеными антителами, и под микроскопом наблюдается специфическая окраска, которая говорит о положительном результате. При этом методе, к сожалению, невозможна количественная интерпретация результата, а только лишь качественная.

Возможность количественного определения дает иммуноферментный анализ(ИФА). Он похож на РИФ, однако в качестве маркеров используют не красители, а ферменты, превращающие бесцветные субстраты в окрашенные продукты, что и дает возможность количественной оценки содержания как антигенов, так и антител.

Отмывают не связавшиеся антитела и антигены.

Добавляют бесцветный субстрат, и в лунках с антигеном, который мы определяем, произойдет окрашивание, т.к. там будет связанный с антигеном фермент, после чего на специальном приборе оценивают интенсивность свечения окрашенного продукта.

По похожей схеме происходит и выявление антител.

Реакция непрямой(пассивной) гемаглютинации (РПГА).

Метод основан на способности вирусов связывать эритроциты. В норме эритроциты падают на дно планшета, образуя так называемую пуговку. Однако если в исследуемом биологическом материале находится вирус, он свяжет эритроциты в так называемый зонтик, который не упадет на дно лунки.

Если стоит задача выявления антител, то сделать это возможно при помощи реакции торможения гемагглютинации (РТГА). В лунку с вирусом и эритроцитами закапывают различные пробы. При наличии антител они свяжут вирус, и эритроциты упадут на дно с образованием «пуговки».

Теперь остановимся на методах диагностики непосредственно нуклеиновых кислот исследуемых вирусов, и прежде всего о ПЦР ( Полимеразная Цепная Реакция) .

Суть этого метода заключается в обнаружении специфического фрагмента ДНК или РНК вируса путём его многократного копирования в искусственных условиях. ПЦР можно проводить только с ДНК, то есть для РНК-вирусов предварительно необходимо произвести реакцию обратной транскрипции.

Непосредственно ПЦР проводят в специальном приборе, под названием амплификатор, или термоциклер, который поддерживает необходимый температурный режим. ПЦР-смесь состоит из добавленной ДНК, которая содержит интересующий нас фрагмент, праймеров (короткий фрагмент нуклеиновой кислоты, комплиментарный ДНК-мишени, служит затравкой для синтеза комплиментарной цепи), ДНК-полимеразы и нуклеотидов.

Стадии цикла ПЦР:

Деннатурация-первая стадия. Температура повышается до 95 градусов, цепочки ДНК расходятся друг относительно друга.

Отжиг праймеров. Температуру понижают до 50-60 градусов. Праймеры находят комплиментарный участок цепи и связываются с ним.

Синтез. Температуру вновь повышают до 72, это рабочая температура для ДНК-полимеразы, которая, отталкиваясь от праймеров, строит дочерние цепи.

Цикл многократно повторяется. Через 40 циклов из одной молекулы ДНК получается 10*12 степени копий копий искомого фрагмента.

При проведении ПЦР в режиме реального времени синтезируемые копии фрагмента ДНК метятся красителем. Прибор регистрирует интенсивность свечения и по ходу реакции строит графики накопления искомого фрагмента.

Современные методы лабораторной диагностики с высокой достоверностью позволяют выявить присутствие вируса — возбудителя в организме, нередко, задолго до появления первых симптомов заболевания.

Источник: cgon.rospotrebnadzor.ru
MedBookAide — путеводитель в мире медицинской литературы

Прозоркина H. В., Рубашкина П. А. — Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

2) инвазией — это способность внедряться во внутреннюю среду организма хозяина и распространяться по его органам и тканям. Микроорганизмы способны вырабатывать различные ферменты агрессии, для преодоления защитных барьеров макроорганизма. К ним относятся: нейраминидаза — фермент, который расщепляет биополимеры, которые входят в состав поверхностных рецепторов клеток слизистых оболочек. Это делает оболочки доступными для воздействия на них микроорганизмов; гиалуронидаза — действует на межклеточное и межтканевое пространство. Это способствует проникновению микробов в ткани организма; дезоксирибо-нуклеаза (ДНКаза) — фермент, который деполимеризирует ДНК, и др. Ферменты микроорганизмов могут действовать местно и генерализованно. Большую роль в преодолении межклеточных барьеров играют жгутики бактерий;

3) капсулообразованием — это способность микроорганизмов образовывать на поверхности капсулу, которая защищает бактерии от клеток фагоцитов организма хозяина (пневмококки, чума, стрептококки). Если капсул нет, то образуются другие структуры: например, у стафилококка — белок А, с помощью этого белка стафилококк взаимодействует с иммуноглобулинами. Такие комплексы препятствуют фагоцитозу. Или же микроорганизмы вырабатывают определенные ферменты: например, плазмокоагулаза приводит к свертыванию белка, который окружает микроорганизм и защищает его от фагоцитоза;

4) токсинообразованием — способность микроорганизмов вырабатывать яды. По своим свойствам токсины делятся на эндотоксины и экзотоксины.

Экзотоксины — это вещества белковой природы, обладают выраженными иммуногенными и антигенными свойствами. Они состоят из двух фрагментов — А и В. В-фрагмент способствует адгезии и инвазии; А-фрагмент обладает выраженной активностью по отношению к внутренним системам клетки.

По типу действия экзотоксины делятся на:

А. Цитотоксины — блокируют синтез белка в клетке (дифтерия, шигеллы);

Б. Мембранотоксины — действуют на мембраны клеток (лейкоцидин стафилококка действует на мембраны клеток фагоцитов или стрептококковый гемолизин действует на мембрану эритроцитов). Наиболее сильные эзотоксины вырабатывают возбудители столбняка дифтерии, ботулизма. Характерной особенностью экзотоксинов является их способность избирательно поражать определенные органы и ткани организма. Например, экзотоксин столбняка поражает двигательные нейроны спинного мозга, а дифтерийный экзотоксин поражает сердечную мышцу и надпочечники.

Для профилактики и лечения токсинемических инфекций применяются анатоксины (обезвреженные экзотоксины микроорганизмов) и антитоксические сыворотки.

Эндотоксины — тесно связаны с телом микробной клетки и освобождаются при ее разрушении. Эндотоксины не обладают таким выраженным специфическим действием, как экзотоксины, а также менее ядовиты. Не переходят в анатоксины. Эндотоксины являются суперантигенами, они могут активизировать фагоцитоз, аллергические реакции. Эти токсины вызывают общее недомогание организма, их действие не отличается специфичностью. Независимо от того, от какого микроба получен эндотоксин, клиническая картина однотипна: это, как правило, лихорадка и тяжелое общее состояние. Выброс эндотоксинов в организм может привести к развитию инфекцион-но-токсического шока.

§ 2. Методы лабораторной диагностики инфекционных заболеваний

Существует 5 основных методов диагностики:

1) микроскопический — позволяет обнаружить возбудителя непосредственно в материале, взятом от больного. Для этого мазок окрашивают различными способами. Этот метод играет решающую роль при диагностике многих инфекционных заболеваний: туберкулеза, малярии, гонореи и др.;

2) бактериологический — заключается в посеве исследуемого материала на питательные среды. Этот метод позволяет выделить возбудителя в чистом виде и изучить его морфологические признаки, ферментативную активность и идентифицировать его;

3) биологический метод — осуществляют путем выделения возбудителя при заражении лабораторных животных, которые восприимчивы к данному заболеванию. Этот метод дорогостоящий, поэтому применяется ограниченно;

4) серологические методы исследования — основаны на выявлении специфических иммунных антител в сыворотке крови больного. Для этого используют различные иммунологические реакции: реакция Видаля (используется для выявления брюшного тифа);

5) аллергический метод — ставятся кожно-аллергические пробы, введение аллергена накожно или внутрикожно; используются для диагностики туберкулеза, туляремии, лепры и т. д.

§ 3. Основы эпидемического процесса

Эпидемический процесс — это возникновение и распространение инфекций среди населения. Для возникновения и непрерывного течения эпидемического процесса необходимо взаимодействие трех факторов: источника возбудителей инфекции, механизма передачи инфекции и восприимчивого населения. Выключение любого из этих звеньев приводит к прерыванию эпидемического процесса. Биологической основой эпидемического процесса служит паразитарная система, т. е. взаимодействие паразита и хозяина.

Возбудители инфекционных болезней делятся по характеристике источников:

АНТРОПОНОЗЫ

ЗООНОЗЫ

Болезни, регистрируемые толь- Болезни животных, которыми болеет ко у людей, т.е. болезни, кото- и человек, т.е. болезни, которыми черыми человек заражается от че- ловек заражается от животных (лиловека (СПИД, сифилис, грипп, шай, бешенство, сибирская язва). корь и др.).

Под механизмом передачи подразумевают способ перемещения возбудителя инфекционных заболеваний из зараженного организма в восприимчивый. Этот механизм включает смену трех фаз: выведение микроорганизма из организма хозяина в окружающую среду; нахождение возбудителя в окружающей среде и внедрение возбудителя в восприим-

4. Зак. 361 чивый организм. Механизмы передачи подразделяются на: фекально-оральный, аэрогенный (воздушно-капельный), кровяной (трансмиссивный), контактный, вертикальный (от матери плоду через плаценту).

По механизму передачи и была предложена Л.В. Громашевским классификация инфекционных болезней (см. выше).

Следующим элементом эпидемического процесса является восприимчивость населения. Если иммунная «прослойка» населения высокая, то можно считать, что достигается состояние эпидемического благополучия и циркуляция возбудителя прекращается. И наоборот, при снижении иммунной прослойки населения увеличиваются те или иные инфекционные заболевания. Так, например, в 90-е гг. в России снизилась иммунная «прослойка» населения к дифтерии, что привело к резкому увеличению дифтерийных больных. Поэтому задачей эпидемиологов является создание в коллективах этой «прослойки» путем проведения массовой вакцинации против соответствующих возбудителей. В последние годы широко применяется противогриппозная вакцинация, что в общем привело к снижению заболеваемости гриппом. Интенсивность эпидемического процесса выражается в показателях заболеваемости и смертности на 10 тыс. или 100 тыс. населения. Эпидемиологи различают три степени интенсивности эпидемического процесса:

Спорадическая заболеваемость — это обычный уровень заболеваемости данной нозологической единицы на одной территории в данный момент времени.

Эпидемия— распространение инфекционных болезней среди населения села, города или области.

Пандемия — распространение инфекционных заболеваний среди населения разных стран и континентов. Например, пандемия чумы в прошлом столетии или распространение ВИЧ-инфекции в XX в.

В соответствии с распространенностью С.В. Прозоровский разделил инфекционные заболевания на: 1) кризисные инфекции — инфекции, угрожающие существованию человеческой популяции (ВИЧ-инфекция);

2) массовые — вызывающие свыше 100 заболеваний на 100 000 населения. Первое место здесь занимают грипп и ОРВИ, на долю которых приходится ежегодно 92,5% всех случаев инфекционной заболеваемости;

3) распространенные управляемые — от 20 до 100 случаев заболевания на 100 тыс. населения. К таким заболеваниям относятся те инфекции, против которых осуществляется вакцинация населения — это дифтерия, столбняк, бруцеллез, коклюш. Хотя, несмотря на наличие профилактических препаратов, нельзя сказать, что все обстоит благополучно. Так, среди привитых против дифтерии заболевание составляет 57%;

4) распространенные неуправляемые — заболеваемость менее 20 случаев на 100 тыс. населения. Это группа инфекций, требующих постоянного внимания в плане научных исследований. Это относится к менингококковой инфекции, лептоспирозам, цитомегаловирусной инфекции и др.;

5) спорадические — единичные случаи заболеваемости на 100 тыс. населения (бешенство, сыпной тиф).

§ 4. Заболевания инфекционной природы.

которые возникают в стационарах, — нозокоииальные (ВБИ)

В инфекционных стационарах соблюдение санитарно-про-тивоэпидемического режима предусматривает распределение больных по нозологическим формам в боксах, текущую и заключительную дезинфекцию, микробиологический контроль.

Этиология: основные возбудители ВБИ — условно-патогенные микробы. Причины:

1) объективные, не зависящие от медицинского персонала;

2) субъективные. 1. Объективные:

а) больницы, отделения, не соответствующие требованиям; б) отсутствие эффективных методов лечения стафилококкового носительства и условий для госпитализации; в) недостаточное число бактериологических лабораторий; г) неоправданно широкое применение антибиотиков; д) множество антибиотикоустойчивых микроорганизмов; е) увеличение лиц со сниженным иммунитетом.

2. Субъективные:

а) недостаточная профилактически направленная деятельность медицинского персонала; б) отсутствие единого эпидемиологического подхода к изучению ВБИ; в) отсутствие должного контроля со стороны работников центров госсанэпиднадзоров; г) отсутствие надежной стерилизации некоторых видов аппаратуры; д) увеличение числа контактов между больными; е) отсутствие полного учета ВБИ; ж) низкое качество стерилизации медицинского инструментария и дезинфекции; з) несовершенная система посещений родственниками.

Эпидемиология:

I. Источники инфекции:

1) медицинский персонал, посетители, страдающие инфекционными заболеваниями (грипп, диарея, гнойничковые);

2) больные со стертыми формами;

3) больные с чистыми ранами, являющиеся носителями вирулентных стафилококковых штаммов;

4) грудные дети с пневмонией, отитом, гриппом, выделяющие патогенные штаммы кишечной палочки.

II. Механизмы передачи: воздушно-капельный, фекаль-но-оральный, контактно-бытовой, возможен парентеральный (гепатит В, С, дельта, ВИЧ).

Предрасполагающие факторы:

1) ослабление больного;

2) длительность пребывания в стационаре (70% ВБИ у больных, лежащих более 20 дней);

3) чрезмерное применение АБ, они изменяют биоценоз кишечника, снижают иммунологическую резистентность;

4) госпитализация большого количества людей преклонного возраста, хронических больных, которые являются источником внутрибольничных инфекций;

5) пребывание в стационаре маленьких детей, особенно до 1 года;

6) большая скученность больных в стационаре.

ВОПРОСЫ для САМОКОНТРОЛЯ

1. Что такое «инфекция»?

2. Как делятся инфекции по локализации микроорганизмов?

3. Назовите и охарактеризуйте периоды инфекционного процесса.

4. Что такое «инфекционно-токсический шок»?

5. Что такое «патогенностъ» и «вирулентность»?

6. Чем обусловлена вирулентность бактерий?

7. Чем отличаются экзотоксины от эндотоксинов?

8. Какие существуют методы диагностики инфекционных заболеваний?

9. Какие вы знаете механизмы передачи инфекционных заболеваний?

10. Что вы можете сказать об основах эпидемического процесса?

§ 1. Понятие об иммунитете

Еще в древние времена было замечено, что человек, который перенес инфекционное заболевание, становится к нему невосприимчивым и повторно не болеет. В средние века людей, переболевших чумой, холерой, привлекали к уходу за больными или к захоронению умерших. Впервые английский врач Э. Дженнер использовал искусственное заражение человека для предохранения его от заболевания оспой. Затем Л. Пастер предложил прививки против бешенства и сибирской язвы. Изучение явлений иммунитета позволило создать вакцины, получить лечебные сыворотки и гамма-глобулины.

В процессе эволюции у человека сформировалась специальная система защиты организма от чужеродных веществ и микроорганизмов, вызывающих заболевания. Эта система называется иммунной системой. Она представлена лимфо-идной тканью и выполняет функции специального надзора, т.е. распознает чужеродные вещества, генетически чуждые макроорганизму. Чужеродные агенты, попадающие в наш организм, называются «антигенами». К ним относятся вещества белковой природы; соединения белков липидов и полисахаридов, микробы и их токсины; вирусы и т. д. А невосприимчивость организма к чужеродным веществам (антигенам) называется «иммунитетом» (от лат. Immunitas — освобождение, избавление от чего-либо).

Иммунный надзор играет важную роль в нормальном функционировании организма, предохраняет от различных болезней инфекционной и неинфекционной природы.

Изучением функционирования иммунной системы, а также разработкой средств и методов иммунологической диагностики, профилактики и лечения инфекционных и неинфекционных болезней занимается иммунология — наука об иммунитете. Иммунология как наука сформировалась лишь в конце XIX в. Основоположниками ее можно считать И.И. Мечникова, Л. Пастера и П. Эрлиха.

Существуют различные классификации видов и форм иммунитета. Наиболее простая классификация:

1) естественный иммунитет:

а) врожденный иммунитет; б) приобретенный иммунитет; в) пассивный иммунитет новорожденных;

2) искусственный иммунитет:

а) активный иммунитет; б) пассивный иммунитет.

1. Естественный врожденный иммунитет является наиболее прочной формой невосприимчивости, которая обусловливается врожденными, биологическими особенностями данного вида. Например, человек не болеет чумой рогатого скота или куриной холерой. Животные не болеют заболеваниями человека: дифтерией, сифилисом и др. Эти свойства невосприимчивости к тем или иным заболеваниям передаются потомству по наследству. Поэтому мы говорим о врожденном иммунитете.

Естественный приобретенный иммунитет возникает после того, как человек перенес инфекционную болезнь, поэтому этот иммунитет также называют постинфекционным. Приобретенный иммунитет индивидуален и по наследству не передается. Если человек в детстве переболел эпидемическим паротитом (свинкой), то это не значит, что его дети не будут болеть этим заболеванием. Длительность приобретенного иммунитета различна и зависит от вида возбудителя. Например, после перенесения одних заболеваний в организме человека образуется длительный, пожизненный иммунитет (чума, эпидемический паротит, коклюш, туляремия и др.), а после перенесения других заболеваний остается непродолжительный, кратковременный иммунитет. Такими инфекциями человек может болеть несколько раз (грипп А, гонорея, ангина и др.).

Невосприимчивость к инфекции возникает не только при выраженной форме заболевания, но и при бессимптомных формах течения болезни.

Пассивный иммунитет новорожденных обусловлен передачей особых защитных веществ-антител — из организма матери плоду через плаценту или ребенку через грудное молоко. Продолжительность такого иммунитета невелика, всего несколько месяцев, но его роль для здоровья ребенка очень важна. Уже точно доказано, что дети, находящиеся на грудном вскармливании, болеют гораздо реже, чем те, которые вскармливаются искусственно.

2. Искусственный иммунитет — его создают в организме человека искусственным путем, чтобы предупредить возникновение инфекционной болезни, а также используют для лечения инфекционных болезней. Различают активную и пассивную формы искусственного иммунитета: активный иммунитет создают у человека путем введения вакцин или анатоксинов. Активный иммунитет может быть напряженным и длительным. Пассивный иммунитет создается путем введения в организм человека иммунных сывороток, в которых содержатся иммунные антитела. Пассивный иммунитет сохраняется недолго, около месяца, до тех пор, пока сохраняются антитела в организме. Затем антитела разрушаются и выводятся из организма. В зависимости от локализации иммунитет может быть общим и местным. Местный иммунитет осуществляет защиту кожных покровов и слизистых оболочек, а общий иммунитет обеспечивает иммунную защиту внутренней среды организма человека. Деление иммунитета на различные виды и формы очень условно, так как защиту организма осуществляют одни и те же системы, органы и ткани. Их функция направлена на то, чтобы поддерживать в организме постоянное нормальное состояние. Защитные факторы, которые обусловливают невосприимчивость человека к заболеваниям, могут быть специфическими и неспецифическими.

§ 2. Неспецифические факторы защиты

Неспецифические факторы защиты врожденные и лишены избирательности, так как действуют на любой микроорганизм.

К первичным барьерам неспецифических факторов защиты относятся:

1. Кожа — покрывает все тело и механически защищает организм от проникновения микробов, вирусов и т.д. На коже также имеются потовые и сальные железы, которые вырабатывают молочную и жирные кислоты. Известно, что кислая среда губительно действует на микроорганизмы. Если на поверхность чистой кожи нанести микробы, то через 30 мин они погибнут. Грязная кожа обладает сниженными бактерицидными свойствами, поэтому мытье рук и тела является важным условием сохранения защитной роли кожи.

2. Слизистые оболочки носоглотки, дыхательных путей, кишечника обладают еще более выраженными защитными свойствами, чем кожа. В слезах, слюне обнаружен лизоцим, который растворяет многие сапрофитные микробы, а также некоторые патогенные. Известно, что в слюне у собак лизоцима содержится в 100 раз больше, чем у человека. Поэтому слюна собак является более бактерицидной. Эпителий слизистых путей также механически препятствует проникновению микроорганизмов, эту роль выполняет слизь и реснитчатый эпителий, освобождающие слизистые оболочки от попавших на них частичек. В желудочно-кишечном тракте защитную роль выполняют соляная кислота желудочного сока, которая убивает микроорганизмы. Еще в древние времена люди знали об этом свойстве, поэтому врач никогда не приходил к больному на «голодный» желудок.

3. Нормальная микрофлора организма человека обладает антагонистическим действием к различным видам микроорганизмов. Она препятствует их размножению и проникновению в организм. Например, кишечная палочка вырабатывает молочную кислоту, которая оказывает губительное действие на бактерии. Если микроорганизмы преодолевают эти барьеры, то в работу вступают вторичные барьеры неспецифических факторов защиты. К ним относятся:

1) гуморальные факторы — система комплемента. Комплемент — это комплекс 26 белков в сыворотке крови. Обозначается каждый белок, как фракция, латинскими буквами: С4, С2, СЗ и т. д. В условиях нормы система комплемента находится в неактивном состоянии. При попадании антигенов он активируется, стимулирующим фактором является комплекс антиген — антитело. С активации комплемента начинается любое инфекционное воспаление. Комплекс белков комплемента встраивается в клеточную мембрану микроба, что приводит к лизису клетки. Также комле-мент участвует в анафилаксии и фагоцитозе, так как обладает хемотаксической активностью. Таким образом, комплемент является компонентом многих им-мунолитических реакций, направленных на освобождение организма от микробов и других чужеродных агентов;

2) клеточные факторы защиты.

Фагоциты. Фагоцитоз (от греч. phagos — пожираю, cytos — клетка) впервые открыл И. И. Мечников, за это открытие в 2020 г. он получил Нобелевскую премию. Механизм фагоцитоза состоит в поглощении, переваривании, инактивации инородных для организма веществ специальными клетками-фагоцитами. К фагоцитам Мечников отнес макрофаги и микрофаги. В настоящее время все фагоциты объединены в единую фагоцитирующую систему. В нее включены: промоноциты — вырабатывает костный мозг; макрофаги — разбросаны по всему организму: в печени они называются «купферовские клетки», в легких — «альвеолярные макрофаги», в костной ткани — «остеобласты» и т. д. Функции клеток-фагоцитов самые разнообразные: они удаляют из организма отмирающие клетки, поглощают и инактивируют микробы, вирусы, грибы; синтезируют биологически активные вещества (лизоцим, комплемент, интерферон); участвуют в регуляции иммунной системы.

Источник: medbookaide.ru

Диагностика инфекционных заболеваний является одной из самых сложных проблем в клинической медицине. Лабораторные методы исследования при ряде нозологических форм играют ведущую, а в целом ряде клинических ситуаций решающую роль не только в диагностике, но и в определении конечного исхода заболевания.

Диагностика инфекционных заболеваний почти всегда предусматривает использование комплекса лабораторных методов.

Сеть независимых лабораторий «Ситилаб» в своей работе для диагностики инфекционных заболеваний использует 3 группы специальных лабораторных методов исследования:

  1. бактериологические;
  2. серологические;
  3. метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) для обнаружения ДНК или РНК возбудителя инфекционного заболевания в исследуемом материале.

У одних пациентов для диагностики этиологии инфекционно-воспалительного процесса достаточно провести бактериологическое исследование, в других клинических ситуациях решающее значение имеют данные серологических исследований, в третьих, предоставить полезную информацию может только метод ПЦР. Однако наиболее часто в клинической практике врачу-клиницисту необходимо использовать данные различных методов лабораторных исследований.

Бактериологические методы исследования

Бактериологические исследования наиболее часто проводят при подозрении на гнойно-воспалительные заболевания (составляют 40-60% в структуре хирургических заболеваний) с целью их диагностики, изучения этиологической структуры, определения чувствительности возбудителей к антибактериальным препаратам. Результаты бактериологических анализов способствуют выбору наиболее эффективного препарата для антибактериальной терапии, своевременному проведению мероприятий для профилактики внутрибольничных инфекций.

Возбудителями гнойно-воспалительных заболеваний являются истинно-патогенные бактерии, но наиболее часто условно-патогенные микроорганизмы, входящие в состав естественной микрофлоры человека или попадающие в организм извне. Истинно-патогенные бактерии в большинстве случаев способствуют развитию инфекционного заболевания у любого здорового человека. Условно-патогенные микроорганизмы вызывают заболевания преимущественно у людей с нарушенным иммунитетом.

Бактериологические исследования при заболеваниях, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами, направлены на выделение всех микроорганизмов, находящихся в патологическом материале, что существенно отличает их от аналогичных исследований при заболеваниях, вызванных истинно патогенными микроорганизмами, когда проводится поиск определенного возбудителя.

Для получения адекватных результатов бактериологического исследования при гнойно-воспалительных заболеваниях особенно важно соблюдать ряд требований при взятии биоматериала для анализа, его транспортировки в лабораторию, проведения исследования и оценки его результатов.

Для идентификации вида возбудителя гнойно-воспалительных заболеваний и определения чувствительности к антибактериальным препаратам бактериологические лаборатории используют комплекс методов. Они включают:

  • микроскопическое исследование мазка (бактериоскопия) из доставленного биоматериала;
  • выращивание культуры микроорганизмов (культивирование);
  • идентификацию бактерий;
  • определение чувствительности к антимикробным препаратам и оценку результатов исследования.

Доставленный в бактериологическую лабораторию биоматериал первоначально подвергается микроскопическому исследованию.

Микроскопическое исследование мазка (бактериоскопия), окрашенного по Граму или другими красителями, проводят при исследовании мокроты, гноя, отделяемого из ран, слизистых оболочек (мазок из цервикального канала, зева, носа, глаза и т.д.). Результаты микроскопии позволяют ориентировочно судить о характере микрофлоры, ее количественном содержании и соотношении различных видом микроорганизмов в биологическом материале, а также дает предварительную информации об обнаружении этиологически значимого инфекционного агента в данном биоматериале, что позволяет врачу сразу начать лечение (эмпирическое). Иногда микроскопия позволяет выявить микроорганизмы, плохо растущие на питательных средах. На основании данных микроскопии проводят выбор питательных сред для выращивания микробов, обнаруженных в мазке.

Культивирование микроорганизмов. Посев исследуемого биоматериала на питательные среды производят с целью выделения чистых культур микроорганизмов, установления их вида и определения чувствительности к антибактериальным препаратам. Для этих целей используют различные питательные среды, позволяющие выделить наибольшее количество видов микроорганизмов. Оптимальными являются питательные среды, содержащие кровь животного или человека, а также сахарный бульон, среды для анаэробов. Одновременно производят посев на дифференциально-диагностические и селективные (предназначенные для определенного вида микроорганизмов) среды. Посев осуществляют на стерильные чашки Петри, в которые предварительно заливают питательную среду для роста микроорганизмов.

Микроскопия мазков, окрашенных по Граму

1 — стрептококки;  2 — стафилококки;  3 — диплобактерии Фридленда;  4 — пневмококки

Чашки Петри с посевами инкубируют в термостате при определенных температурных, а для ряда микроорганизмов газовых (например, для выращивания анаэробов создают условия с низким содержанием кислорода) режимах в течение 18-24 ч. Затем чашки Петри просматривают. Количественную обсемененность доставленного биоматериала микрофлорой определяют по числу колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл или 1 мг исследуемого образца. При просмотре чашек Петри выявляют некоторые особенности изменения цвета среды, ее просветления в процессе роста культуры. Многие группы бактерий образуют характерные формы колоний, выделяют пигменты, которые окрашивают колонии или среду вокруг них. Из каждой колонии делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Оценивают однородность бактерий, форму и размер, наличие спор или других включений, капсулы, расположение бактерий, отношение к окраске по Граму. Вся эта информация служит важнейшей составляющей для выбора сред и получения в дальнейшем чистой культуры каждого микроорганизма.

Колонии отсевают на плотные, жидкие, полужидкие питательные среды, оптимальные для культивирования определенного вида бактерий.

Выделенные чистые культуры микроорганизмов подвергают дальнейшему изучению в диагностических тестах, основанных на морфологических, ферментативных, биологических свойствах и антигенных особенностях, характеризующих бактерий соответствующего вида или варианта.

Идентификация  — это комплекс бактериологических методов изучения бактерий, позволяющий определить вид микроорганизма. В Лаборатории «Ситилаб» идентификация большинства видов бактерий и грибов осуществляется на автоматическом бактериологическом анализаторе с использованием диагностических панелей зарубежного производства. На бланке результата исследования в виде наименования микроорганизма или его рода, например, Streptococcus pneumoniae (пневмококк) или Eschrichia coli (кишечная палочка).

Определение чувствительности к антибактериальным препаратам.  Чувствительность к антимикробным препаратам изучают у выделенных чистых культур микроорганизмов имеющих этиологическое значение для данного заболевания. Поэтому в направлении на бактериологические анализы требуется указать диагноз заболевания у больного. Определение чувствительности бактерий к спектру антибиотиков помогает лечащему врачу правильно выбрать препарат для лечения больного.

В Лаборатории «Ситилаб» определение чувствительности выделенной чистой культуры большинства видов бактерий и грибов осуществляется на автоматическом бактериологическом анализаторе с использованием диагностических панелей зарубежного производства к широкому спектру современных антибактериальных препаратов (от 6 до 32 препаратов, в зависимости от выделенного микроорганизма) с определением минимальной ингибирующей концентрации (МИК). На бланке результатов определения чувствительности к антибактериальным препаратам обозначение R — указывает на резистентность, I — умеренную чувствительность, S — чувствительность микроорганизма к данному препарату.

Оценка результатов исследования.  Принадлежность условно-патогенных микроорганизмов к естественной микрофлоре организма человека создает ряд трудностей при оценке их этиологической роли в развитии гнойно-воспалительных заболеваний. Условно-патогенные микроорганизмы могут представлять нормальную микрофлору исследуемых жидкостей и тканей или контаминировать их из окружающей среды. Поэтому для правильной оценки результатов бактериологических исследований необходимо знать состав естественной микрофлоры изучаемого образца. В тех случаях, когда исследуемый биоматериал в норме стерилен, как, например, спинномозговая жидкость, экссудаты, все выделенные из него микроорганизмы могут считаться возбудителями заболевания. В тех случаях, когда исследуемый материал имеет собственную микрофлору, как, например, отделяемое влагалища, кал, мокрота, нужно учитывать изменения ее качественного и количественного состава, появление несвойственных ему видов бактерий, количественную обсемененность биоматериала. Так, например, при бактериологическом исследовании мочи степень бактериурии (число бактерий в 1 мл мочи), равная и выше 105, свидетельствует об инфекции мочевых путей. Более низкая степень бактериурии встречается у здоровых людей и является следствием загрязнения мочи естественной микрофлорой мочевых путей.

Установить этиологическую роль условно-патогенной микрофлоры помогают также нарастание количества и повторность выделения бактерий одного вида от больного в процессе заболевания.

Врач-клиницист должен знать, что положительный результат бактериологического исследования в отношении биологического материала, полученного из в норме стерильного очага (кровь, плевральная жидкость, спинномозговая жидкость, пунктат органа или ткани), всегда тревожный результат, требующий немедленных действий по оказанию медицинской помощи.

Серологические методы исследования

В основе всех серологических реакций лежит взаимодействие антигена и антитела. Серологические реакции используются в двух направлениях.

1. Обнаружение с диагностической целью антител в сыворотке крови обследуемого. В этом случае из двух компонентов реакции (антитело, антиген) неизвестным является сыворотка крови, так как постановка реакции проводится с заведомо известными антигенами. Положительный результат реакции свидетельствует о наличии в крови антител, гомологичных применяемому антигену; отрицательный результат указывает на отсутствие таковых. Достоверные результаты получают при исследовании «парных» сывороток крови больного, взятой в начале заболевания (3-7-й день) и через 10-12 дней. В этом случае удается наблюдать динамику нарастания антител. При вирусных инфекциях лишь четырехкратное и большее повышение титра антител во второй сыворотке имеет диагностическое значение.

С внедрением в практику лабораторий метода иммуноферментного анализа (ИФА) стало возможным определять в крови больных антитела, относящиеся к различным классам иммуноглобулинов (IgM и IgG), что существенным образом повысило информативность серологических методов диагностики. При первичном иммунном ответе, когда иммунная система человека взаимодействует с инфекционным агентов в первый раз, синтезируются преимущественно антитела, относящиеся к иммуноглобулинам класса М. Лишь позднее, на 8-12 день после попадания антигена в организм, в крови начинают накапливаться антитела иммуноглобулинов класса G. При иммунном ответе на инфекционные агенты вырабатываются также и антитела класса А (IgA), которые играют важную роль в защите от инфекционных агентов кожи и слизистых оболочек.

2. Установление родовой и видовой принадлежности микроба или вируса. В этом случае неизвестным компонентом реакции является антиген. Такое исследование требует постановки реакции с заведомо известными иммунными сыворотками.

Серологические исследования не обладают 100 % чувствительностью и специфич-ностью в отношении диагностики инфекционных заболеваний, могут давать перекрестные реакции с антителами, направленными к антигенам других возбудителей. В связи с этим оценивать результаты серологических исследований необходимо с большой осторожностью и учетом клинической картины заболевания. Именно этим обусловлено использование для диагностики одной инфекции множества тестов, а также применение метода Western-blot для подтверждения результатов скрининговых методов.

В последние годы прогресс в области серологических исследований связан с разработкой тест-систем для определения авидности специфических антител к возбудителям различных инфекционных заболеваний.

Авидность — характеристика прочности связи специфических антител с соответствующими антигенами. В ходе иммунного ответа организма на проникновение инфекционного агента стимулированный клон лимфоцитов начинает вырабатывать сначала специфические IgM-антитела, а несколько позже и специфические IgG-антитела. IgG-антитела обладают поначалу низкой авидностью, то есть достаточно слабо связывают антиген. Затем развитие иммунного процесса постепенно (это могут быть недели или месяцы) идет в сторону синтеза лимфоцитами высокоспецифичных (высокоавидных) IgG-антител, более прочно связывающихся с соответствующими антигенами. На основании этих закономерностей иммунного ответа организма в настоящее время разработаны тест-системы для определения авидности специфических IgG-антител при различных инфекционных заболеваниях. Высокая авидность специфических IgG-антител позволяет исключить недавнее первичное инфицирование и тем самым с помощью серологических методов установить период инфицирования пациента. В клинической практике наиболее широкое распространение нашло определение авидности антител класса IgG при токсоплазмозе и цитомегаловирусной инфекции, что дает дополнительную информацию, полезную в диагностическом и прогностическом плане при подозрении на эти инфекции, в особенности при беременности или планировании беременности.

Метод полимеразной цепной реакции

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) являющаяся одним из методов ДНК-диагностики, позволяет увеличить число копий детектируемого участка генома (ДНК) бактерий или вирусов в миллионы раз с использованием фермента ДНК-полимеразы. Тестируемый специфический для данного генома отрезок нуклеиновой кислоты многократно умножается (амплифицируется), что позволяет его идентифицировать. Сначала молекула ДНК бактерий или вирусов нагреванием разделяется на 2 цепи, затем в присутствии синтезированных ДНК-праймеров (последовательность нуклеотидов специфична для определяемого генома) происходит связывание их с комплементарными участками ДНК, синтезируется вторая цепь нуклеиновой кислоты вслед за каждым праймером в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы. Получается две молекулы ДНК. Процесс многократно повторяется. Для диагностики достаточно одной молекулы ДНК, то есть одной бактерии или вирусной частицы. Введение в реакцию дополнительного этапа — синтеза ДНК на молекуле РНК при помощи фермента обратной транскриптазы — позволило тестировать РНК-вирусы, например, вирус гепатита С. ПЦР — это трехступенчатый процесс, повторяющийся циклично: денатурация, отжиг праймеров, синтез ДНК (полимеризация). Синтезированное количество ДНК идентифицируют методом иммуноферментного анализа или электрофореза.

В ПЦР может быть использован различный биологический материал — сыворотка или плазма крови, соскоб из уретры, биоптат, плевральная или спинномозговая жидкость и т.д. В первую очередь ЦПР применяют для диагностики инфекционных болезней, таких как вирусные гепатиты В, С, D, цитомегаловирусная инфекция, инфекционные заболевания, передающиеся половым путем (гонорея, хламидийная, микоплазменная, уреаплазменная инфекции), туберкулез, ВИЧ-инфекция и т.д.

Преимущество ПЦР в диагностике инфекционных заболеваний перед другими методами исследований заключается в следующем:

  • возбудитель инфекции может быть обнаружен в любой биологической среде организма, в т.ч. и материале, получаемом при биопсии;
  • возможна диагностика инфекционных болезней на самых ранних стадиях заболевания;
  • возможность количественной оценки результатов исследований (сколько вирусов или бактерий содержится в исследуемом материале);
  • высокая чувствительность метода; например чувствительность ПЦР для выявления ДНК вируса гепатита В в крови составляет 0,001 пг/мл (приблизительно 4,0.102 копий/мл), в то время как метода гибридизации ДНК с использованием разветвленных зондов — 2,1 пг/мл (приблизительно 7,0.105 копий/мл).
Источник: citilab.ru

Инфекции вызывают, в основном, следующие виды микроорганизмов: бактерии, вирусы, грибы, простейшие. Их обнаружение — достоверный признак инфекционного процесса.

Лаборатория располагает арсеналом методов, однако только 5 из них наиболее широко распространены:

Культуральный метод (метод посева)

Выявляет чистую культуру возбудителя. Метод сводится к тому, что полученный материал (мазок со слизистой оболочки, кровь, гной, кал и т.д) высевается на питательные среды. Среды могут содержать различные компоненты. Но суть сводится к следующему: микроорганизмы должны дать рост и колонии. Если есть рост патогенных микроорганизмов, то определяется их чувствительность к лекарствам: антибиотикам и бактериофагам.

Серологический метод (метод антител к возбудителю)

Тоже позволяет поставить диагноз. Метод основан на обнаружении в крови антигенов возбудителя или антител — специальных белков, которые образуются в организме в ответ на присутствие и размножение болезнетворных микроорганизмов. Антитела образуются постепенно, поэтому в крови их можно обнаружить только к концу первой недели инфицирования. Это главный недостаток метода.

Молекулярно-биологический метод (метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), метод амплификации РНК (NASBA))

Определяет генетический материал возбудителя — ДНК или РНК в образцах (соскоб со слизистой, кровь, моча, кал и т.д). Чтобы уловить малые концентрации ДНК или РНК, необходимо увеличить количество копий. Для этого исследуемый образец помещают в прибор — амплификатор, который позволяет увеличить число копий ДНК в геометрической прогрессии. Для этого метода диагностики крайне важен правильный забор биоматериала.

Микроскопический метод (исследование под микроскопом)

Подразумевает приготовление препаратов на стекле. Материал: кровь, отделяемое слизистых оболочек и т.д. Стекла могут быть окрашенными или неокрашенными, в зависимости от типа инфекции. Врач исследует препарат под микроскопом и выдает результат на основании визуальной оценки: размер, форма, отношение к красителям и т.д.

Метод газовой хроматографии (ГХ-МС)

Выявляет возбудителей по продуктам их жизнедеятельности. Материал: кровь, моча, кал, отделяемое ран, слизистых оболочек.

Источник: dnkom.ru

С целью диагностики вирусных инфекций применяются следующие методы:

Ø Вирусоскопический – обнаружение в исследуемом материале вирусов с помощью световой (крупные вирусы, внутриклеточные включения вирусов), люминесцентной и электронной микроскопии;

Ø Вирусологический – выделение вирусов из исследуемого материала с последующей их идентификацией (установление вида и типа вируса посредством серологических реакций);

Ø Серологический – обнаружение в исследуемом материале антигенов вирусов или вирусоспецифических антител;

Ø Биологический – заражение вируссодержащим материалом лабораторных животных;

Ø Молекулярно-биологический – выявление в исследуемом материале нуклеиновых кислот вирусов (ПЦР, ДНК-зонды);

Ø Экспресс-методы – выявление антигенов вирусов в короткие сроки (РИФ);

Ø Аллергологический – выявление ГЗТ к вирусу.

Этапы вирусологического метода исследования:

1. Взятие материала (выбор материала определяется клиническими признаками заболевания, местом размножения вируса в организме и путями его выделения), транспортировка в лабораторию и подготовка к исследованию (для подавления сопутствующей бактериальной флоры обрабатывают антибиотиками).

2. Заражение исследуемым материалом чувствительной модели. Вирусы в отличии от бактерий не растут на питательных средах, т.к. являются абсолютными (облигатными) паразитами, поэтому для их культивирования применяются особые модели:

Ø в организме восприимчивых животных;

Ø в куриных эмбрионах (овокультуры);

Ø в культуре клеток.

3. Культивирование вируса в зараженной модели при стандартных условиях (оптимальная температура, продолжительность культивирования).

4. Индикация (обнаружение) вируса в зараженной модели.

5. Идентификация выделенного вируса в серологических реакциях.

Достоинство вирусологического метода – 100% достоверность.

Культивирование вирусов в организме чувствительных животных – на первом этапе развития вирусологии был единственным методом, доказывающим наличие фильтрующихся агентов в исследуемом материале.

Требования, предъявляемые к лабораторным животным:

Ø животное должно быть чувствительным к данному вирусу;

Ø использование новорожденных/молодых особей;

Ø использование инбридных (беспородных) животных/гнотобионтов (выращены в безмикробной среде);

Ø использование здоровых животных одной линии (одного пола, возраста, веса, содержащихся в одинаковых условиях).

Способ заражения животных определяется тропизмом вируса (способностью репродуцироваться в определенных типах клеток):

Ø нейротропен (например, вирус бешенства) – вводится интрацеребрально;

Ø пневмотропен (например, РС-вирусы) – интраназально;

Ø дерматропен (например, вирус натуральной оспы) – внутрикожно;

Ø пантропен – внутривенно/внутрибрюшинно.

Методы индикации вируса в организме лабораторного животного:

1) клинические симптомы заболевания;

2) гибель животного;

3) патоморфологические изменения органов при вскрытии.

Достоинства – выделение тех вирусов, которые не культивируются в куриных эмбрионах и культурах клеток.

Недостатки – контаминация животных посторонними микроорганизмами.

Культивирование вирусов методом овокультур – заражение вирусами куриных эмбрионов.

Требования, предъявляемые к куриным эмбрионам:

Ø должны быть из эпидемиологически благополучных хозяйств;

Ø скорлупа должна быть чистой, непигментированной, без механических повреждений;

Ø возраст – 5-12 дней (недостаточно противовирусных ингибиторов).

Способы заражения куриных эмбрионов:

Ø закрытый (прокол иглой под контролем овоскопа);

Ø открытый (с удалением части скорлупы).

Исследуемый материал вводят в аллантоисную и амниотические полости, хорион-аллантоисную оболочку и желточный мешок. Перед заражением скорлупу над воздушной камерой обрабатывают 70% этиловым спиртом и фломбируют (обжигают на пламени). После заражения отверстие в скорлупе заливают расплавленным парафином. Инкубируют при 35-370С ≈ 48 часов.

Методы индикации вируса в куриных эмбрионах:

1) результаты овоскопии – отсутствие подвижности эмбриона, слабая инъецированность сосудов кровью и отсутствие их пульсации;

2) паталогоанатомические изменения на хорион-аллантоисной оболочке – отечность, кровоизлияния, наличие оспинок (узелков);

3) отставание эмбриона в росте и развитии, пороки развития, гибель;

4) положительная реакция гемагглютинации (РГА) – через 5-10 минут при смешивании аллантоисной жидкости и суспензии эритроцитов (кур, гусей, уток, морских свинок и других животных) на дне лунки полистеролового планшета образуется осадок в виде «перевернутого зонтика» вследствие склеивания эритроцитов под действием вируса (отрицательная РГА – эритроциты не склеиваются и выпадают в осадок в виде «пуговки»).

Достоинства – высокая чувствительность к большому спектру вирусов.

Недостатки – обнаружение вируса только после вскрытия эмбриона.

Дата добавления: 2014-12-05; просмотров: 5707;

Источник: helpiks.org

Лабораторная диагностика инфекционных заболеваний проводит­ся по следующим направлениям: 1) обнаружение возбудителя заболе­вания в патологическом материале; 2) обнаружение специфических антител в сыворотке крови больного (серологическая диагностика); 3) выявление у больного повышенной чувствительности к возбудителю с помощью аллергических проб.

Обнаружение и идентификацию возбудителя заболевания прово­дят, используя микроскопический, микробиологический и биологи­ческий методы.

Микроскопический метод используется для обнаружения возбу­дителя непосредственно в патологическом материале. Может приме­няться как самостоятельный метод в отношении некоторых микроор­ганизмов с характерной морфологией. С помощью микроскопическо­го метода можно сделать заключение при обнаружении гонококков в гное, менингококков в спинномозговой жидкости, палочек туберкулеза, а также простейших: плазмодиев малярии, лейшманий, дизентерийной амебы. Микроскопия применяется как обязательный этап исследова­ния при микробиологическом методе.

Микробиологический метод применяется для выделения чистой культуры микробов и их идентификации по ряду признаков: морфоло­гии, способности окрашиваться красителями (тинкториальные свойс­тва), характеру роста на питательных средах (культуральные свойства), ферментации углеводов, белков и других веществ (биохимические свой­ства) и по антигенной структуре. Для эпидемиологического анализа проводят внутривидовую идентификацию — определение серовара, фа-говара, биовара. С целью назначения рациональной антибиотикоте-рапии определяют чувствительность выделенной культуры к антибио­тикам.

Для экспресс-диагностики применяют РИФ со специфическими сы­воротками. Метод позволяет выявить возбудителя в исследуемом ма­териале в течение нескольких часов.

В последнее время для идентификации микробов применяют ме­тоды, основанные на исследовании состава ДНК. Для этого сущест­вует несколько методов.

1) Определение процентного соотношения гуанин + цитозин/ аденин + тимин (Г+Ц/А+Т) (см. главу 4).

2) Определение последовательности нуклеотидов в ДНК микроба. С этой целью путем нагревания вызывают разделение ДНК на две нити, добавляют ДНК-зонд — участок известной ДНК, меченный радиоактивной меткой, или ферментом, или биотином. ДНК-зонд присоединяется к од­ной из нитей исследуемой ДНК, если он комплементарен, то есть соот­ветствует ей. Присоединение обнаруживается по наличию метки.

3) Полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволяет увеличить ко­личество исследуемой ДНК с помощью фермента полимеразы и таким образом обнаружить даже небольшие количества ДНК.

Биологический метод заключается в заражении животных иссле­дуемым материалом с последующим выделением чистой культуры или в обнаружении токсина и определения его вида и типа.

Серологические методы направлены на выявление специфических антител в сыворотке крови пациента. Для этого используют реакции иммунитета. С целью выявления динамики нарастания титра антител исследуют парные сыворотки, полученные от пациента в начале бо­лезни и через 1-3 недели.

Аллергический метод применяется для выявления повышенной чув­ствительности к возбудителю путем постановки внутрикожных проб с аллергеном.

Взятие материала на исследование и пересылка его в лабораторию.Результат микробиологического исследования во многом зависит от правильного взятия и пересылки материала в лабораторию. Выбор ма­териала зависит от характера заболевания и локализации патологи­ческого процесса. Исследуют мокроту, гной, испражнения, мочу, кровь и др. Материал следует брать до лечения антибиотиками, в достаточ­ном количестве, в стерильную посуду, с соблюдением приемов, обеспе­чивающих стерильность. Посуда и инструменты для взятия материала не должны содержать следов дезинфицирующих веществ. Испражне­ния собирают в стерильные картонные тарелки; используют также суд­на, обработанные дезинфицирующим раствором и тщательно промы­тые горячей водой. Мочу берут стерильным катетером. Рвотные массы собирают в стерильные банки, мокроту в стерильные банки с пробкой или в чашки Петри. Гнойное отделяемое ран берут стерильным ватным тампоном или исследуют тампоны, извлеченные из ран при перевязках. Соскобы со слизистых оболочек зева и носа — стерильным ватным там­поном на проволоке.

Специальные приемы используются при коклюше (метод кашле-вых пластинок), при исследовании на менингококковое носительство (носоглоточный тампон).

Материал для исследования на неспорообразующие анаэробы при взятии и пересылке тщательно оберегают от соприкосновения с воздухом.

Кровь для посева берут с соблюдением правил асептики, пред­варительно протерев кожу 70% спиртом, стерильным шприцем из лок­тевой вены в количестве 5-10 мл и сразу же засевают во флакон с жид­кой питательной средой, количество которой должно быть в 10 раз

дырка

эпидермальный и S. saprophyticus — сапрофитный стафиркокк. Забо­левания чаще вызывают золотистые, реже — эпидермальные, еще реже — сапрофитные стафилококки.

Морфология, культуральные, биохимические свойства.Стафило­кокки имеют шаровидную форму, в чистой культуре располагаются в виде гроздьев винограда, в мазках из гноя располагаютсяя поодиночке, попарно, небольшими скоплениями (цветная вклейка рис. 25). Факуль­тативные анаэробы, лучше растут в аэробных условиях, при рН 7,2-7,8, на простых питательных средах. Оптимальная температура для роста 37оС.

В жидких питательных средах образуют равномерное помутнение, на плотных средах образуют гладкие, выпуклые, блестящие, с ровными краями колонии. Благодаря образованию пигмента колонии могут быть золотистого, палевого, лимонно-желтого, белого цвета. Пигментообразование лучше всего выражено на средах с добавлением молока. Ста­филококки могут размножаться на средах с большим количеством (8-10%) хлорида натрия, поэтому солевые среды применяются в качестве элективных: молочно-солевой агар, желточно-солевой агар.

Стафилококки сбраживают углеводы с образованием кислоты без газа, обладают протеолитическими свойствами. S. aureus отличаются от двух других видов тем, что продуцируют фермент, вызывающий свер­тывание плазмы крови (плазмокоагулазу), ферментируют маннит в ана­эробных условиях, продуцируют токсины и ферменты патогенности (табл. 4).

Наличие пигмента не является таксономическим признаком.

Антигены.Стафилококки содержат целый ряд полисахаридных и белковых антигенов. Классификация по антигенной структуре не по­лучила практического применения.

Фаговары.По чувствительности к типовым бактериофагам ста­филококки делятся на фаговары. Фаготипирование проводится с по­мощью международного набора бактериофагов.

Токсинообразование.Патогенные стафилококки продуцируют эк­зотоксины. Гемолизины вызывают гемолиз эритроцитов разных видов животных и человека. Основным из них является альфа-гемолизин, на ос­нове которого приготовлен стафилококковый анатоксин. Стафило­кокки, продуцирующие гемолизин, образуют на кровяном агаре коло­нии, окруженные бесцветной зоной гемолиза. Лейкоцидины разруша­ют лейкоциты. Эксфолиатины вызывают пузырчатку новорожденных, отслойку эпителия кожи с образованием пузырей, «синдром ошпарен­ной кожи». Обнаружен токсин, вызывающий токсический шок (ТТШ). Энтеротоксины, вызывающие пищевую интоксикацию, в отличие от других экзотоксинов, термостабильны, не разрушаются при кипячении.

Ферменты, обладающие патогенным действием: гиалуронидаза, лецитиназа, плазмокоагулаза.

Стафилококки, устойчивые к пенициллину и другим b-лактамным антибиотикам, продуцируют b-лактамазу.

дырка

ях, при постоянной циркуляции стафилококков среди больных могут формироваться так называемые «госпитальные» стафилококки опре­деленных фаготипов, высоковирулентные, обладающие множественной лекарственной устойчивостью, нечувствительные к дезинфицирующим средствам. Особенно большое значение в возникновении внутрибольничных инфекций имеют стафилококки, устойчивые к пенициллину, метициллину.

Заболевания у человека.Стафилококковые заболевания чаще воз­никают в результате заражения извне, реже — как эндогенная инфекция.

Стафилококки, главным образом, S. epidermidis, являются предста­вителями нормальной микрофлоры кожи человека, дыхательных пу­тей и пищеварительного тракта.

У здоровых людей довольно часто встречается носительство S. aureus, главным образом, на слизистой оболочке носа. Установлено, что только небольшая часть людей постоянно свободна от золотистого стафилококка. У большинства они обнаруживаются периодически, часть людей являются постоянными бактерионосителями. Имеется ка­тегория носителей, у которых постоянно и в большом количестве оби­тают S. aureus с признаками «госпитальных» штаммов. Такие носите­ли, особенно среди медицинского персонала, а также больные со ста­филококковыми заболеваниями, являются основным источником ста­филококковых инфекций в больницах.

Инфекция передается, главным образом, контактным путем или через воздух.

Стафилококки вызывают разнообразные гнойно-воспалительные заболевания: гнойничковые поражения кожи и подкожной клетчатки, ангины, отиты, пневмонии, уретриты, холециститы, энтероколиты, сеп­сис и т.д. Особенно велика их роль в акушерской практике и в хирур­гии. Стафилококки нередко являются причиной гнойно-воспалительных заболеваний у новорожденных, маститов у рожениц, гнойных после­операционных осложнений, постинъекционных абсцессов. Возбу­дителями чаще всего являются S. aureus.

S. epidermidis вызывает заболевания такие, как инфекционный эн­докардит и другие, главным образом, у ослабленных больных, в отде­лениях интенсивной терапии, где заражение может происходить через системы для внутрисосудистых вливаний, различные катетеры из по­лимерных соединений.

S. saprophyticus являются частой причиной острых инфекций мочевыводящих путей у молодых женщин.

Особое место занимают пищевые интоксикации, возникающие в результате употребления в пищу продуктов (чаще всего молочных и сладких блюд), в которых произошло размножение стафилококков и накопление энтеротоксина. Этот токсин термоустойчив, и даже после термической обработки продукты, содержащие энтеротоксин, могут вызвать пищевое отравление.

Стафилококки могут явиться причиной токсического шока. Впер-

вые вспышка этого синдрома возникла в США в 2020 году, у женщин, пользующихся во время менструации гигроскопичными гигиеническими тампонами. У заболевших наблюдалось повышение температуры тела, гиперемия слизистых оболочек, боли в мышцах, кожная сыпь с шелу­шением, падение кровяного давления. Заболевание возникало только при использовании тампонов, выпускаемых одной из фирм. было ус­тановлено, что случаи токсического шока возникали вследствие ряда причин: тампоны содержали карбоксиметилцеллюлозу с глюкозой и соединениями натрия, обладали сунерадсорбирующимп свойствами, поэтому чрезмерно высушивали слизистую оболочку и травмировали ее; при инфицировании стафилококками происходило их быстрое раз­множение в благоприятной среде, чему способствовало присутствие натрия в составе тампона. После запрета на продажу продукции этой фирмы вспышка прекратилась. В дальнейшем токсический шок наблю­дался у хирургических больных, особенно при использовании гигрос­копичных перевязочных материалов определенных сортов.

Было установлено, что токсический шок вызывают стафилокок­ки, продуцирующие экзотоксин, названный токсином токсического шока (ТТШ).

Иммунитет.Человек обладает в некоторой степени врожденной ус­тойчивостью к стафилококкам благодаря защитным свойствам кожи, фагоцитозу, наличию нормальных антител.

После перенесенного заболевания иммунитет непродолжительный. Характерна склонность к рецидивам. Восприимчивость к стафи­лококковой инфекции возрастает при травмах, диабете, действии ионизирующих излучений.

Стафилококковые заболевания не относятся к острозаразным, больных лечат не в клиниках инфекционных болезней, а в других отде­лениях больниц.

Лабораторная диагностика.Материалом для исследования являют­ся гной, слизь из зева и носа, мокрота, кровь, испражнения, моча; при пищевых отравлениях — рвотные массы, промывные воды желудка, пищевые продукты.

Микроскопия мазка из исследуемого материала позволяет обна­ружить грамположительные кокки и отметить их количество. Для вы­деления чистой культуры производят посевы на элективные для стафи­лококка среды (молочно-солевой или желточно-солевой агар) и среды для стрептококка (кровяной агар). В случае, если выделена чистая куль­тура стафилококка, определяют видовую принадлежность по призна­кам: плазмокоагулаза, анаэробное сбраживание и аэробное окисле­ние глюкозы и маннита, гемолиз на кровяном агаре, наличие лецити-назы, ДНК-азы. Определяют чувствительность к антибиотикам. В це­лях эпидемиологического анализа проводят фаготипирование.

При пищевых отравлениях определяют наличие энтеротоксина в пищевом продукте с помощью специфических антисывороток или биоп­робы на котятах.

Профилактические и лечебные препараты.Стафилококковый ана­токсин нативный, применяется для активной иммунизации с целью ле­чения при хронических заболеваниях. Стафилококковый анатоксин очищенный адсорбированный прменяется, главным образом, для про­филактики.

Иммуноглобулин человеческий противостафилококковый содер­жит стафилококковый антитоксин, приготовлен из крови доноров, иммунизированных стафилококковым анатоксином. Применяется для создания пассивного иммунитета с целью лечения.

Стафилококковый антифагин (вакцина) — для создания активного иммунитета с целью лечения.

Стафилококковый бактериофаг жидкий. Применяется наружно, внутрикожно, внутримышечно для лечения.

Стрептококки.

Стрептококки впервые были обнаружены Т. Бильротом в 2020 г. при рожистом воспалении и Л. Пастером в 2020 г. при гнойных за­болеваниях и сепсисе. Выделены в чистой культуре Ф. Розенбахом в 2020 г.

В медицине наиболее важное значение имеют: Streptococcus pyogenes (пиогенный стрептококк), S. pneumoniae (пневмококк), S. faecalis (энтерококк).



Источник: infopedia.su

Государственное образовательное учреждение высшего

профессионального образования

«Северо-Осетинская Государственная медицинская академия

Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

КАФЕДРА МИКРОБИОЛОГИИ, ВИРУСОЛОГИИ И ИММУНОЛОГИИ

МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ

ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ

Методические рекомендации для студентов педиатрического, лечебного,

стоматологического, фармацевтического, медико-профилактического факультетов, факультета высшего сестринского образования

Владикавказ 2007

Методические рекомендации «Методы лабораторной диагностики инфекционных болезней» составлены заведующей кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии СОГМА д. м.н., профессором, , ассистентом кафедры к. м.н. ; ассистентом ОЙ.

Рецензенты:

—  Зав. кафедрой основ медицинских знаний СОГУ, к. м.н. ;

—  Зав. курсом детских болезней лечебного факультета кафедры поликлинической педиатрии СОГМА д. м.н., профессор .

«Инфекция» (лат. infectio– заражение), или «инфекционный процесс», представляет собой совокупность физиологических и патологических, адаптационных и репарационных реакций, которые возникают и развиваются в макроорганизме в процессе взаимодействия с патогенными микроорганизмами, вызывая нарушения его внутренней среды и физиологических функций. Таким образом, если в результате взаимодействия организма человека с патогенным микроорганизмом расстраиваются физиологические функции, нарушается его жизнедеятельность, то возникает инфекционная болезнь, проявляющаяся клиническими симптомами. Инфекционное заболевание не только вызывается, но и поддерживается присутствием в организме живого повреждающего чужеродного агента (возбудителя). На его воздействие организм и отвечает защитными реакциями, но инфекцию нельзя отождествлять только с микробом – возбудителем болезни, поскольку он является одним из факторов, обусловливающих развитие патологического процесса, но не определяет это состояние в целом. Инфекционный процесс в организме человека протекает обязательно в определённых условиях внешней среды, проявляется на молекулярном, субклеточном, клеточном, тканевом, органном и организменном уровнях (в результате взаимодействия микроба с макроорганизмом прежде всего страдает клетка, через которые он в последующем проникает в макроорганизм; сам процесс взаимодействия происходит на уровне комплементарных структур макромолекул микроба и эукариотической клетки макроорганизма; процессы, протекающие на молекулярном и клеточном уровнях, а именно взаимодействие факторов патогенности микробов с клеточными и гуморальными факторами защиты макроорганизма, отражаются на тканево-органном уровне — тканевая дифференциация клеток хозяина обуславливает специфичность инфекционного процесса и выполняет защитную роль, ограничивая зоны размножения микробов, поэтому основные черты патогенеза инфекционного процесса формируются на тканево-органном уровне, отражаясь в последующем на организменном уровне, определяя манифестность проявлений инфекционного процесса) и закономерно заканчивается либо гибелью человека, либо его полным освобождением от возбудителя.

Возникновение, течение и исход инфекционного процесса определяются тремя группами факторов:1) количественные и качественные характеристики микроба — возбудителя инфекционного процесса; 2)состояние макроорганизма, степень его восприимчивости к микробу; 3) действие физических, химических и биологических факторов окружающей микроб и макроорганизм окружающей внешней среды. При этом микроб определяет специфичность инфекционного процесса, а решающий вклад в форму проявления инфекционного процесса, его длительность, степень тяжести проявлений и исход вносит состояние макроорганизма, прежде всего факторы его неспецифической резистентности, на помощь которым приходят факторы специфического приобретённого иммунитета.

ЦЕЛЬЮ НАСТОЯЩЕЙ РАБОТЫ является объединение существующих методов лабораторной диагностики инфекционных болезней, тем самым, оказывая помощь студентам и практическим врачам инфекционных отделений Детской городской клинической больницы в освоении раздела параклинических методов исследований.

Среди многочисленных методов лабораторной диагностики особенно большую роль играют методы обнаружения возбудителя (бактериоскопический и бактериологический) и выявление нарастания титра специфических антител в динамике заболевания (серологический, иммуноферментный, радиоиммунный и др.).

I. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ И БАКТЕРИОСКОПИЧЕСКИЙ МЕТОДЫ

Материалом для бактериологического исследования служат различные выделения больного. Правильный микробиологический диагноз инфекционного заболевания во многом зависит от адекватного забора материала (важно получить образцы из патологического очага до начала антимикробной терапии, собрать достаточное количество материала, избегая его контаминации; своевременно доставить образцы в лабораторию).

Для обнаружения возбудителя используют методику непосредственного микроскопирования материала от больного (при малярии, лептоспирозе, менингококковой инфекции, лямблиозе, амебиазе и др.) или метод бактериологического посева на селективные среды.

При острых желудочно-кишечных инфекциях (шигеллез, сальмонеллез, эшерихиозы, большая группа кишечных заболеваний, вызванных условно-патогенными микробами — клебсиелла, протей, стафилококки, клостридии и др.) бактериологический метод имеет наибольшее значение. Наилучшие результаты дает посев материала непосредственно у постели больного, взятого до начала лечения антибиотиками. Для посева используют комочки слизи и, особенно, гноя, не следует брать кровь. При невозможности немедленного посева испражнения в объеме 1-2 г помещают в консервант — обычно глицериновую смесь и хранят в условиях холодильника при температуре +8°С. Для исследования производят также забор рвотных масс, промывных вод желудка, остатков пищи, трупного материала и др. При отсутствии стула испражнения получают непосредственно из прямой кишки. Посев материала производят на селекционные среды Плоскирева, Левина, Эндо, висмут-сульфитный агар и др.

Выделение чистых культур включает 3 этапа: 1) получение изолированных колоний бактерий из исследуемого материала; 2)пересев материала из колоний на скошенный агар для получения чистой культуры; 3) идентификация выделенной чистой культуры, определение чувствительности к антибиотикам и только после этого лаборатория выдаёт окончательный результат.

При соблюдении всех правил забора, хранения и посева материала шигеллы обнаружить удается в 60-70% случаев.

Широко используется метод гемокультуры (посев крови) при брюшном тифе, паратифах, менингококкцемии, лептоспирозе, септических состояниях, а также при заболеваниях, вызываемых условно-патогенной флорой. Обнаружение возбудителя в этих случаях указывает на этиологию заболевания.

Высоко информативно также обнаружение возбудителя в посевах из зева при дифтерии. Материал для посева берут с места локализации дифтерийного процесса, с обязательным забором слизи с миндалин и носа. Материал с миндалин берут отдельными тампонами натощак или через 2 часа после еды. При наличии налетов материал следует брать с границы пораженных и здоровых тканей. Тампоны должны быть доставлены в лабораторию не позже трех часов после взятия материала. Для выявления коринебактерий дифтерии используют кровяно-теллуритовую среду.

Предварительный результат можно получить уже через сутки. Окончательный ответ, с указанием токсичности и биохимического варианта (гравис или митис) выделенных коринебактерий выдается через 48-72 часа.

В последнее время в практическую работу бактериологических лабораторий внедряется ускоренный метод индикации токсина — реакции нейтрализации антител (РНА) с коммерческим дифтерийным антигеном (анатоксинным эритроцитарным диагностикумом — ДАгЭД). Предварительный ответ, в котором сообщается о нахождении токсина возбудителя дифтерии в РНА, ориентирует врача на более ранее введение ПС и способствует своевременному проведению противоэпидемических мероприятий в очаге инфекции.

Большое значение имеет бактериологическое исследование ликвора и мазков крови (толстая капля) на наличие менингококка; обнаружение возбудителя в карбункуле (при сибирской язве), лимфатическом узле (при туляремии, чуме).

При вирусных инфекциях для выделения возбудителя используют материалы от больного для посева на первичные культуры клеток почек обезьян, клетки Hela, эмбриональные клетки человека, а также в амниотическую полость куриных эмбрионов или путем заражения лабораторных животных (белые мыши, кролики, морские свинки и др.). Однако проведение методов выделения и идентификации вирусов весьма трудоемко и требует много времени, поэтому широкого распространения в повседневной работе они не получили и используются преимущественно для ретроспективной диагностики или для расшифровки эпидемических вспышек гриппа, полиомиелита, аденовирусных, энтеровирусных и других заболеваний.

II. КОПРОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ

Полное копрологическое исследование слагается из морфологического, химического, паразитологического и в отдельных случаях бактериологического и бактериоскопического исследований.

Морфологическое и химическое исследование дают суммарное представление о функции важнейших пищеварительных желез, оно отражает степень переваривания принятой пищи и состояния слизистой кишечного тракта. Элементы слизистой оболочки кишечника — слизь, эритроциты, лейкоциты, эпителиальные клетки, макрофагы, клетки злокачественных опухолей; клеточные элементы обнаруживаются в слизи. СЛИЗЬ имеет вид светлых тяжей с наличием в них клеточных элементов. В норме слизь микроскопически обнаруживается редко с единичными эпителиальными клетками и лейкоцитами. Количество слизи увеличивается при заболеваниях кишечника (колит, дизентерия, язвенные процессы и др.).

КЛЕТКИ ЦИЛИНДРИЧЕСКОГО ЭПИТЕЛИЯ — в них почти всегда выражены дегенеративные изменения — зернистость, вакуолизация, разбухание, в результате чего клетки округляются. В большом количество они обнаруживаются при острых воспалительных процессах.

ЛЕЙКОЦИТЫ (в основном нейтрофилы) указывают на воспалительные процессы, располагаются группами и тяжами. Обнаруживают при дизентерии, амебиазе, язвенном колите.

ЭОЗИНОФИЛЫ — в виде единичных клеток часто находят среди нейтрофилов. В больших количествах обнаруживают при амебиазе, гельминтозах, при аллергических состояниях.

МАКРОФАГИ, ПОЛИБЛАСТЫ, ПЛАЗМАТИЧЕСКИЕ КЛЕТКИ — различить в нативном препарате невозможно. При необходимости цитологического исследования дифференцировка их производится в препаратах, приготовленных в виде тонких мазков из слизи и гноя и окрашенных по Романовскому. При цитологическом исследовании препаратов можно судить о наличии:

1) острого воспалительного процесса — (в препаратах нейтрофилы и эритроциты, макрофаги);

2) хронического воспалительного процесса (лимфоциты, нейтрофилы, полибласты, плазматические клетки).

ЭРИТРОЦИТЫ — в норме не встречаются. Обнаруживаются в кале при язвенных воспалительных процессах, трещинах слизистой кишечника, распаде опухолей и других поражениях толстого кишечника.

III. ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНТНЫЙ МЕТОД В качестве экспресс-диагностики многих инфекционных заболеваний (грипп, ОРВИ, корь, сальмонеллез и др.), используется иммунофлюоресцентный метод. Он основан на использовании явления люминесценции для выявления реакции антиген-антитело, происходящей на поверхности клеток или срезах ткани. Метод при определенном навыке можно считать универсальным, сочетающим в себе точный морфологический анализ с высокой специфичностью и разрешающей способностью. Метод прост — на взятый от больного материал, содержащий антиген, наносят специфическую люминесцентную сыворотку (антитело). После реакции препарат промывают и изучают под люминесцентным микроскопом. Метод высокочувствителен и позволяет получить положительный результат через несколько часов от начала исследования. С помощью этого метода можно идентифицировать практически любое антигенное вещество вирусной, бактериальной или другой природы. Он используется для обнаружения бактерий, простейших, риккетсий, вирусов в чистых и смешанных культурах, препаратах-отпечатках, срезах органов и тканей.

IV. СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ (РА) — используется для определения неизвестных антител с помощью известного антигена и установления вида микроба с помощью известных антител. РА широко используется для диагностики брюшного тифа (реакция Видаля), иерсиниоза, бруцеллеза, туляремии и др. Реакция Видаля ставится с конца первой — начала второй недели заболевания, так как в этот период в крови появляются антитела. Реакция Видаля ставится с соматическим О-и жгутиковым Н-антигенами. О-антитела образуются с 4-5-го дня болезни, в период реконвалесценции уровень их постепенно снижается и они исчезают. Н-антитела появляются со 2-3 недели заболевания, сохраняются в течение 2-3 месяцев после выздоровления и у привитых против брюшного тифа. Положительной считается реакция с разведения 1:200 при нарастании титра в динамике заболевания и установления вида микроба с помощью известных антител.

РЕАКЦИЯ ПАССИВНОЙ (РПГА), ИЛИ НЕПРЯМОЙ,

ГЕМАГЛЮТИНАЦИИ (РНГА).

По чувствительности она превышает РА. Это достигается использованием эритроцитов, на поверхности которых сорбируются антигены (бактериальные или вирусные) или антитела. Эритроциты, сенсибилизированные антигенами, называются антигенными эритроцитарными диагностикумами и используют для выявления и титрования антител. Эритроциты, сенсибилизированные антителами, именуют иммуноглобулиновыми эритроцитарными диагностикумами и применяют для выявления антигенов. РПГА широко используется для диагностики гриппа, аденовирусной инфекции, брюшного тифа, паратифов, шигеллезов, сальмонеллеза, вирусных энцефалитов, вирусного гепатита В и др.

РЕАКЦИЯ ТОРМОЖЕНИЯ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РТГА)

она основана на способности некоторых вирусов (кишечные вирусы, вирус гриппа, арбовирусы и др.), вызывать агглютинацию эритроцитов. Сущностью реакции является феномен торможения иммунной сывороткой гемаглютинации эритроцитов вирусами.

РТГА — основной метод серодиагностики кори, краснухи, паротитной инфекции, гриппа, клещевого энцефалита и других вирусных инфекций, возбудители которых обладают гемагглютинирующими свойствами.

РЕАКЦИЯ ИММУНОДИФФУЗИИ (РИ) — используется для выявления как антигенов, так и антител. Принцип этой реакции используется для диагностики гриппа, вирусного гепатита В, определения стафилококкового токсина, токсигенности дифтерийных бактерий и др. Разновидностью этого метода являются радиоиммунофорез и иммуноэлектрофорез.

В последние годы принцип иммунодиффузии широко используется для раздельного определения специфических JgM и JgG в исследуемой сыворотке крови. Метод позволяет одновременно определять титры антител и принадлежность их к определенному классу иммуноглобулинов.

РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМЛЕМЕНТА (РСК) — позволяет титровать антигены или антитела по степени фиксации комплемента комплексом антиген-антитело. Реакция широко применяется для диагностики риккетсиозных и вирусных инфекций.

РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ (РН) — основана на способности антител нейтрализовать бактериальные токсины и вирусные антигены. Широко используется для обнаружения и титрования антистрептолизина, антистафилолизина, дифтерийного токсина, для обнаружения практически всех известных вирусов. Результаты реакции учитываются in vitro или по биологическому эффекту.

ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ (ИФА) — основан на использовании антител, коньюгированных с ферментами (пероксидаза и щелочная фосфотаза). ИФА — наиболее перспективный метод диагностики практически всех вирусных, бактериальных и других инфекций.

РАДИОИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД (РИМ) — основан на применении радиоизотопной метки антигенов или антител.

В настоящее время специфическая диагностика гепатитов основана исключительно на определении антител к вирусу класса JgM и JgG радиоиммунным или иммуноферментным анализом. Оба метода высокочувствительны и специфичны.

В начале гепатита появляются антитела класса JgM, их синтез начинается еще до появления первых клинических симптомов и нарастает в острой фазе болезни, а затем титр антител постепенно снижается, анти ВГА JgM исчезают из циркуляции через 6-8 месяцев болезни. Антитела JgM обнаруживаются у всех больных гепатитом, независимо от тяжести болезни, в том числе и при всех стертых, безжелтушных и иннапарантных формах. Синтез специфических антител класса JgG начинается в более поздние сроки болезни, обычно на 2-3 неделе от начала заболевания, их титр возрастает более медленно, достигая максимума на 5-6 мес. периода реконвалесценции. Поэтому для диагностики гепатита А на всех этапах болезни используется только определение анти-ВГА-класса JgM. Диагностическое значение антител класса JgG может быть только в случае нарастания титра в динамике заболевания.

ГЕНОДИАГНОСТИКА ИНФЕКЦИЙ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ.

Изобретение принципа полимеразной цепной реакции (ПЦР) американским ученым Мюллисом в 2020 г., удостоенным за это открытие Нобелевской премией в 2020 г., стало настоящим прорывом как в молекулярной биологии и генетике, так и в биологии и медицине.

Метод ПЦР является одним из новейших молекулярно-генетических методов, применяющихся для анализа ДНК.

Метод ПЦР позволяет специфично увеличивать (амплифицировать) количество исследуемого образца ДНК в десятки и сотни раз. Специфичность, высокая чувствительность, простота и удобство проведения анализа, сравнительно небольшие затраты времени являются признанными достоинствами метода. Благодаря своим достоинствам, данный метод широко применяется на практике при диагностике вирусных и бактериальных инфекций, диагностике генетических заболеваний, НИА типирования, определении отцовства, в судебно-медицинской практике.

Изолированное умножение гена или его фрагмента называют амплификацией, которая является одним из способов выживания микроорганизмов и клеток животных, например, в условиях действия противоопухолевых и противобактериальных препаратов. ПЦР позволяет за 2-3 часа получать миллион копий специфического участка ДНК вируса, бактерии или клеток крови. Основные достоинства ПЦР — это высокая специфичность, пригодность любого материала, малое количество материала (несколько микролитров; исключение возможности инфицирования персонала в процессе проведения НИР; получение результата в течение дня; превосходит ИФА по чувствительности, более чем в 2020 раз).

В лабораториях на базе ГКБ № 5 г. Москва ведется разработка ПЦР-генодиагностических тест-систем в отношении вирусных инфекций (СПИД, гепатит В и С, цитомегало — герпес-вирусные инфекции и бактериальных инфекций (дифтерия, менингит, туберкулез, хламидиоз, бруцеллез, токсоплазму, геликобактериоз и др.); проводятся методические семинары для специалистов России и стран зарубежья.

Серологические методы исследования широко используются для диагностики практически всех инфекционных заболеваний. Эти методы просты, чувствительны и доступны для практических лабораторий.

Умелое использование всего комплекса диагностических методов исследования существенно облегчает диагностику инфекционных болезней в каждом конкретном случае. С помощью современных высокочувствительных методов обнаружения антигенов и антител можно практически во всех случаях точно и своевременно установить этиологию инфекционной болезни.

Литература:

1.  Воробьёв микробиология, вирусология и иммунология», 2004г.

2.  А., , Широбоков и санитарная микробиология, 2003г.

3.  Тец к практическим занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии, 2002г.

4.  Бойченко диагностика бактериальных инфекций (учебное пособие).

Информационно издательский отдел

Северо-Осетинской государственной медицинской академии.

Подписано в печать 12.02.07г. Тираж 2020 экз.

Формат издания 60х84 усл. печ. л. 0,5

Заказ № 10

Источник: pandia.ru

Существует 5 основных методов диагностики:

1) микроскопический — позволяет обнаружить возбудителя непосредственно в материале, взятом от больного. Для этого мазок окрашивают различными способами. Этот метод играет решающую роль при диагностике многих инфекционных заболеваний: туберкулеза, малярии, гонореи и др.;

2) бактериологический — заключается в посеве исследуемого материала на питательные среды. Этот метод позволяет выделить возбудителя в чистом виде и изучить его морфологические признаки, ферментативную активность и идентифицировать его;

3) биологический метод — осуществляют путем выделения возбудителя при заражении лабораторных животных, которые восприимчивы к данному заболеванию. Этот метод дорогостоящий, поэтому применяется ограниченно;

4) серологические методы исследования — основаны на выявлении специфических иммунных антител в сыворотке крови больного. Для этого используют различные иммунологические реакции: реакция Видаля (используется для выявления брюшного тифа);

5) аллергический метод — ставятся кожно-аллергические пробы, введение аллергена накожно или внутрикожно; используются для диагностики туберкулеза, туляремии, лепры и т. д.

§ 3. Основы эпидемического процесса

Эпидемический процесс — это возникновение и распространение инфекций среди населения. Для возникновения и непрерывного течения эпидемического процесса необходимо взаимодействие трех факторов: источника возбудителей инфекции, механизма передачи инфекции и восприимчивого населения. Выключение любого из этих звеньев приводит к прерыванию эпидемического процесса. Биологической основой эпидемического процесса служит паразитарная система, т. е. взаимодействие паразита и хозяина.

Возбудители инфекционных болезней делятся по характеристике источников:

АНТРОПОНОЗЫ

ЗООНОЗЫ

Под механизмом передачи подразумевают способ перемещения возбудителя инфекционных заболеваний из зараженного организма в восприимчивый.

Этот механизм включает смену трех фаз:

выведение микроорганизма из организма хозяина в окружающую среду;

нахождение возбудителя в окружающей среде и

внедрение возбудителя в восприимчивый организм.

Механизмы передачи подразделяются на:

фекально-оральный,

аэрогенный (воздушно-капельный),

кровяной (трансмиссивный),

контактный,

вертикальный (от матери плоду через плаценту).

По механизму передачи и была предложена Л.В. Громашевским классификация инфекционных болезней (см. выше).

Следующим элементом эпидемического процесса является восприимчивость населения.

Если иммунная «прослойка» населения высокая, то можно считать, что достигается состояние эпидемического благополучия и циркуляция возбудителя прекращается. И наоборот, при снижении иммунной прослойки населения увеличиваются те или иные инфекционные заболевания. Так, например, в 90-е гг. в России снизилась иммунная «прослойка» населения к дифтерии, что привело к резкому увеличению дифтерийных больных. Поэтому задачей эпидемиологов является создание в коллективах этой «прослойки» путем проведения массовой вакцинации против соответствующих возбудителей. В последние годы широко применяется противогриппозная вакцинация, что в общем привело к снижению заболеваемости гриппом. Интенсивность эпидемического процесса выражается в показателях заболеваемости и смертности на 10 тыс. или 100 тыс. населения.

Эпидемиологи различают три степени интенсивности эпидемического процесса:

Спорадическая заболеваемость — это обычный уровень заболеваемости данной нозологической единицы на одной территории в данный момент времени.

Эпидемия— распространение инфекционных болезней среди населения села, города или области.

Пандемия — распространение инфекционных заболеваний среди населения разных стран и континентов. Например, пандемия чумы в прошлом столетии или распространение ВИЧ-инфекции в XX в.

В соответствии с распространенностью С.В. Прозоровский разделил инфекционные заболевания на:

1) кризисные инфекции — инфекции, угрожающие существованию человеческой популяции (ВИЧ-инфекция);

2) массовые — вызывающие свыше 100 заболеваний на 100 000 населения. Первое место здесь занимают грипп и ОРВИ, на долю которых приходится ежегодно 92,5% всех случаев инфекционной заболеваемости;

3) распространенные управляемые — от 20 до 100 случаев заболевания на 100 тыс. населения. К таким заболеваниям относятся те инфекции, против которых осуществляется вакцинация населения — это дифтерия, столбняк, бруцеллез, коклюш. Хотя, несмотря на наличие профилактических препаратов, нельзя сказать, что все обстоит благополучно. Так, среди привитых против дифтерии заболевание составляет 57%;

4) распространенные неуправляемые — заболеваемость менее 20 случаев на 100 тыс. населения. Это группа инфекций, требующих постоянного внимания в плане научных исследований. Это относится к менингококковой инфекции, лептоспирозам, цитомегаловирусной инфекции и др.;

5) спорадические — единичные случаи заболеваемости на 100 тыс. населения (бешенство, сыпной тиф).

Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]

  • #
  • #
  • #

    09.05.20155.04 Mб40Практикум.doc

  • #
  • #
  • #
  • #
  • #
  • #
  • #
  • #
Источник: studfile.net

При лабораторной диагностике инфекционных болезней, вызываемых бактериями, применяются основные методы исследований:

1. Бактериоскопический — приготовление мазков, окраска по Граму, специальными методами и микроскопирование под иммерсионной системой микроскопа.

2. Бактериологический — посев на обычные, специальные питательные среды для выделения, изучения культуральных и биохимических свойств чистой культуры возбудителя болезни.

3. Биологический — определение патогенности выделенных микроорганизмов (постановка биопробы), заражение лабораторных животных.

4. Серологический — идентифицирование бактерий по сыворотке крови, взятой от больных животных и переболевших животных в различных серологических реакциях: реакция агглютинации (РА), реакция преципитации (РА), реакция гемагглютинации (РГА), реакция диффузной преципитации (РДП), реакция иммунофлюарисценции (РНФ), реакция пассивной гемагглютинации (РПГА), реакция нейтрализации и др.

Для диагностики вирусных болезней животныхиспользуют различные методы лабораторных исследований. Все методы лабораторной диагностики вирусных болезней животных делят на три группы:

1. Экспресс-методы.

2. Вирусологические методы.

3. Методы ретроспективной диагностики.

1. Экспресс-методы основаны главным образом на быстром обнаружении в патматериале гемагглютининов в реакции гемагглютинации, вируса или его антигенов с помощью:

2. Серологических тестов: реакций иммунофлуоресценции (РИФ), связывания комплемента (РСК), иммуноферментного анализа (ИФА), диффузионной преципитации в геле (РДП).

3. Световой микроскопии.

4. Электронной микроскопии.

5. Вирусологические методы основаны на изоляции активных форм вирусов из патматериала и их идентификации в серологических реакциях. Вирусологические методы длительны и трудоемки, но дают точный ответ о возбудителе болезни.

Для выделения вируса приготовленной из патматериала суспензией заражают чувствительные объекты, в качестве которых используют восприимчивых и лабораторных животных, куриные эмбрионы, культуры клеток. Выбор чувствительной системы и методы ее заражения зависят от ее чувствительности к выделяемому вирусу и его тропизма.

Идентификация вируса. Она основывается главным образом на реакциях антиген-антитело. В них используются известные специфические диагностические сыворотки, каждая из которых нейтрализует только определенный вирус.

Выбор серологической реакции для окончательной идентификации вируса определяется в основном свойствами самого вируса. При наличии у вируса гемагглютинирующих свойств его идентифицируют в реакции торможения гемагглютинации (РТГА), если вирус проявил гемадсорбирующие свойства в культуре клеток – в РТГАд (реакция торможения гемадсорбции). При отсутствии названных свойств у выделенного вируса его надежно идентифицируют в РН (реакция нейтрализации), РСК (реакция связывания комплемента), РДП (реакция диффузионной преципитации в геле).

Результаты вирусологических исследований считают положительными при наличии клинических проявлений у животных того же вида, от которого был взят исследуемый материал. При экспериментах в куриных эмбрионах или культуре клеток проводится доказательство этиологической роли выделенного вируса. Установление нарастания титра антител к выделенному вирусу в парных сыворотках от животных, послуживших источником получения патологического материала, является доказательством этиологической роли выделенного вируса.

Дата добавления: 2014-02-17; просмотров: 3378; Опубликованный материал нарушает авторские права? | Защита персональных данных |

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Читайте также:

Источник: studopedia.ru